大蒜素油软胶囊的功效 大蒜素对炎症性肠病的治疗作用

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炎症性肠病(IBD)是一种肠道的非特异性慢性炎症,包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD),病因不明确,多与环境、遗传、感染、免疫等因素有关。目前治疗主要以抗炎、抑制免疫为主,但治疗过程中可能出现复发、副作用等情况,如过敏、粒细胞减少等。研究发现合适的治疗可以使约50%-60%患者对药物治疗有反应,20%-30%可以维持缓解。

大蒜是日常生活中常见的食品,被认为具有抗感染作用。在大蒜消耗量高的人群中,胃肠道肿瘤的相对危险度有所下降。它可以促进肿瘤细胞的凋亡,并引起多种差异蛋白的表达,如AnnexinⅠ、Galectin、VDAC-1等。大蒜素是大蒜提取物,安全性较高,研究中发现有抗炎、促凋亡、抗肿瘤的作用。它可以抑制肿瘤细胞SW620、HCT116的生长,也抑制了NF-κB(?)舌化。NF-κB同时是IBD的关键环节,大蒜素可能通过NF-κB发挥抗炎作用。选择和建立合适的动物模型是研究药物治疗不可缺少的重要方法。IBD的动物模型制作方法多样,化学性诱导是其中一种广泛而稳定的方法。TNBS灌肠法是其中一种,可以造成经典的慢性结肠炎,从免疫类型分型看,近似于人类CD[5,6],诱导后可产生持续的炎症病变。

为了验证大蒜素在体内的抗炎作用,首先建立了大鼠结肠炎模型,通过药物干预后各种炎症指标的检测,评价治疗效果。为了进一步研究大蒜素发挥抗炎作用的机制,我们选取了人类结肠腺癌上皮Caco-2细胞进行研究。它在体外培养生长达到融合后可自发分化形成极性,表现出成熟肠道上皮细胞的形态结构和功能特征,是研究结肠上皮蛋白表达及其功能的理想细胞。IBD发生与进展过程中,NF-κB起着重要作用,该通路下游有很多作用靶点。多种炎症因子等可使IKB磷酸化,亚基p65活化移入细胞核。而其活化可使IL-1β、TNF-α基因转录增强而高表达,它们又可再次激活NF-κB。IL-10是反向调节因子,IL-1β和TNF-α使其增加,IL-10又可阻断NF-κB、TNF-α的活化。

NF-κB活性指标也可以作为炎症程度评估的标志。在哺乳动物中,MAPK通路广泛存在,NF-κB是其中的一个作用靶点,它广泛参与了细胞的炎症、增殖、分化、凋亡等多个方面。MAPK通路高度保守,每条通路均有三级激酶参与,触发的因素有多种生长因子、细胞因子、激素、蛋白等。通过级联反应,最终可引起部分细胞因子分泌水平改变,进而体现生物作用,影响炎症程度的改变和转归。MAPK通路的活化可使很多导致炎症及免疫反应的细胞因子增加,如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等。p38MAPK通路在人类自身免疫中有重要意义,很多物理、化学因素刺激均可引起该通路激活,如紫外线辐射、激素、IL-1、TNF-α等细胞因子等,p38MAPK可使核NF-κB复合体中的TATA结合蛋白发生磷酸化,从而调节NF-κB的转录活性；JNK通路在炎症、凋亡、神经发育中均起作用,可被辐射、环境因素及生长因子激活；ERK通路可依据刺激强度及持续时间调节细胞增殖、分化,有研究发现大蒜素可以使其活化后介导细胞凋亡[38]。因此,MAPK通路也可以成为抗炎治疗的靶点,通过改变不同通路活性,最终影响炎症程度。前期动物实验中我们发现,大蒜素可以改变大鼠血清炎症因子水平。

由此推测大蒜素可能通过影响MAPK通路活性,减少NF-κBp65向细胞核内转移,达到调控炎症的目的。我们利用IL-1β诱导Caco-2细胞,可以模拟肠道炎症细胞状态,用以研究大蒜素对MAPK通路的作用。以大蒜素干预后,通过细胞上清炎症因子检测、核蛋白NF-κBp65含量检测,明确大蒜素对细胞的抗炎作用；进一步检测细胞中p38、ERK、JNK通路变化,推测大蒜素抗炎作用的机制。基于以上研究背景及理论基础,本研究探讨了大蒜素对于体内、体外IBD的作用,其与MAPK通路的关系。

2、观察大蒜素单独使用及分别与美沙拉嗪、柳氮磺吡啶联合使用的疗效；3、在IL-1β诱导的Caco-2细胞中检测大蒜素作用后MAPK通路的变化。

方法1、80只Wistar大鼠分为空白对照组、TNBS模型组、大蒜素预防组(30mg/kg)、美沙拉嗪组(30mg/kg)、柳氮磺吡啶组(100mg/kg)、大蒜素灌胃组、美沙拉嗪联合大蒜素组、柳氮磺吡啶联合大蒜素组。大蒜素预防组在造模前以30mg/kg大蒜素灌胃,共2周。造模当日以50mg/kgTNBS乙醇溶液灌肠。造模24h后,空白对照组、模型组及大蒜素预防组大鼠分别以生理盐水灌胃；美沙拉嗪组以30mg/kg艾迪莎混悬液灌胃；柳氮磺吡啶组以100mg/kg柳氮磺吡啶混悬液灌胃；大蒜素组以30mg/kg灌胃；美沙拉嗪联合大蒜素组及柳氮磺吡啶联合大蒜素组分别为二者混悬液,剂量同上；每日1次,时间固定,持续14d。记录各组大鼠体重变化,肉眼及内镜观察结肠大体改变,用光学显微镜观察大鼠结肠病理学变化。ELISA检测大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平。2、选取Caco-2细胞株,利用不同浓度及时间的大蒜素、IL-1p处理细胞,MTT检测,确定安全范围。细胞接种于直径60mm培养皿中,分组：孔白对照组、0.1ng/mlIL-1β组、1ng/mlIL-1β、10ng/mlIL-1β组、10μg/ml大蒜素+1ng/mlIL-1β组、25μg/ml大蒜素+1ng/mlIL-1β组(含大蒜素组处理时先加入大蒜素,2h后加入IL-1p使终浓度为1ng/ml,持续培养至相应时间),各培养12h、24h、48h后收集细胞上清、核蛋白。接种细胞于六孔板中,分组：空白对照组、1ng/mlIL-1β组、25μg/ml大蒜素组、25μg/ml大蒜素+1ng/mlIL-1β组,培养24h后收集细胞全蛋白。ELISA检测细胞上清IL-8水平；Westernblot检测细胞核NF-κBp65含量及MAPK各通路磷酸化水平变化。3、统计：数据均用均数±标准差表示,采用SPSS13.0统计软处理。组织评分数据进行多个独立样本的非参数检验(Kruskal-WallisHTest)。计量资料比较,方差齐性时采用One-wayANOVA检验,组间多重比较采用LSD-t检验；方差不齐时采用近似方差分析法Welch法,组间多重比较采用DunnettT3检验；细胞上清IL-8浓度采用析因资料设计的方差分析。P<0.05表示差异显著,有统计学意义。结果1、大鼠体重：TNBS造模组2天后体重低于对照组。各治疗组大鼠体重较造模组均有升高。大蒜素灌胃组、柳氮磺吡啶联合大蒜素组与美沙拉嗪联合大蒜素治疗组体重无显著差异；至实验结束,大蒜素灌胃组、美沙拉嗪组与美沙拉嗪联合大蒜素组大鼠体重无显著差异。2、组织HE染色评分：造模组、大蒜素预防组、各治疗组评分均高于空白对照组,显示造模成功；与造模组比较,大蒜素预防组、各治疗组评分均低于造模组,显示预防和治疗都有显著保护作用,联合美沙拉嗪使用,组织评分在治疗组中最低。3、TNBS组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平较空白组显著升高；各治疗组TNF-α、IL-1β水平较TNBS组均有下降,但仍高于正常对照组；美沙拉嗪组、柳氮磺吡啶组无显著差异；美沙拉嗪联合大蒜素组二者含量最低。IL-4、IL-10水平在TNBS造模组显著降低；与造模组相比,各治疗组IL-4水平均有升高但低于对照组,美沙拉嗪联合大蒜素组IL-4水平高于其它治疗组；IL-10水平各治疗组间无显著差异。4、梯度浓度的IL-1β刺激Caco-2细胞12h、24h、48h,ELISA检测见细胞上清IL-8含量在一定范围内随IL-1β浓度增大及作用时间延长而增加。核蛋白westernblot分析见：NF-κBp65亚基含量随IL-1β浓度增大而增加。加入大蒜素预先干预后,核蛋白中NF-κBp65亚基含量较对照组升高,但相比1ng/mlIL-1β组,表达量有下降,25μg/ml大蒜素组下降更显著；但上清IL-8含量变化不大。该趋势在12h、24h、48h一致。5、1ng/mlIL-1β可以激活p38、ERK、JNK通路；提前2h加入25μg/ml大蒜素可减弱p38、ERK通路的活化,但可激活ERK通路；单独加入25μg/ml大蒜素并不引起p38、JNK通路变化,可激活ERK通路。因此,大蒜素可抑制炎症情况下p38、JNK的磷酸化,增强ERK活化。

探讨了大蒜素对在体动物炎症性肠病模型的治疗作用,尤其是与常规IBD治疗药物联合应用的疗效；并在离体肠上皮细胞中对其作用机制做出部分研究。通过实验得到以下结论：1、TNBS可以成功诱导出大鼠结肠炎模型。大蒜素灌胃可以缓解该造模产生的炎症,且治疗效果优于预防效果。单独应用效果与美沙拉嗪及柳氮磺吡啶相比并无显著差别,但大蒜素与美沙拉嗪联合应用后,炎症指标有明显好转。2、IL-1β作用于Caco-2细胞可引起促炎因了IL-8的升高,这种现象有时间及浓度依赖性。大蒜素单独用于Caco-2细胞并不引起IL-8的显著变化,预先用于IL-1β诱导的Caco-2细胞,也不会使IL-8含量有显著升高或降低。3、IL-1p诱导的Caco-2细胞核中,NF-κBp65亚基含量会随其浓度的升高而增大。单独以大蒜素刺激Caco-2细胞后,核内NF-κBp65亚基含量并无明显变化；但大蒜素刺激Caco-2细胞2h后,再以IL-1p诱导该细胞,可见细胞核内NF-κBp65亚基含量较单独使用IL-1β细胞下降,增加大蒜素浓度可增强这种作用。4、大蒜素可以抑制细胞中p38、JNK、NF-κB通路活化,可能是引起炎症因了变化、发挥抗炎作用的原因。

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