白花蛇舌草对肝有危害吗？能否抑制肝癌细胞增殖

很多朋友对于白花蛇舌草对肝有危害吗和能否抑制肝癌细胞增殖不太懂，今天就由小编来为大家分享，希望可以帮助到大家，下面一起来看看吧！

2020年癌症全球流行病学调查表明原发性肝癌发病率和死亡率分别排名第六和第三。

原发性肝癌包括肝细胞癌（以下简称HCC）、肝内胆管癌和肝细胞胆管细胞混合癌，HCC占85%～90%。

我国肝癌年龄调整发病率逐年下降，但疾病负担仍呈上升趋势。

肝癌筛查与监测系统尚不健全，大多数患者确诊时已是中晚期，失去根治性治疗机会；手术患者术后5年转移、复发率高达40%～70%。

晚期HCC患者可选择索拉菲尼、仑伐替尼或系统化疗，但均存在不同程度副作用及耐药性；

二线治疗方案临床效益尚未明确，不良反应大；联合治疗常由于增毒效应导致患者不耐受。

因此开发低毒性、有效的新药及治疗策略对晚期HCC预后至关重要。

白花蛇舌草是中医治疗HCC使用频率最高的中药之一。

目前白花蛇舌草抗HCC机制及疗效未明，研究剂型主要为水煎剂，研究表明白花蛇舌草水煎剂主要活性成分为多糖类，与机体免疫相关。

前期研究发现白花蛇舌草乙醇提取物含黄酮类化合物，可体外抑制HepG2.2.15和Hep3B肝癌细胞活性。

研究表明黄酮类化合物具有多靶点抗HCC作用，故本研究对白花蛇舌草进行乙醇溶性成分提取，探究其抗HCC疗效。

对MHCC97-H细胞株进行PCR分析，可检测出HBsAg、HBxAg扩增产物；其皮下移植、肝内原位移植均表现为肺优先转移特性，免疫组化表明移植瘤中转移相关分子表达强阳性，因此MHCC97-H细胞株与临床常见HCC患者有HBV感染、易发生肺转移特性相符。

本研究以高低转移性肝癌细胞MHCC97-H、MHCC97-L为研究对象，以肿瘤化疗药5-FU为阳性对照药，体外观察白花蛇舌草乙醇提取物对HCC细胞增殖的影响；

通过构建裸鼠MHCC97-H移植瘤模型观察白花蛇舌草乙醇提取物体内对HCC细胞的影响，结合移植瘤指数增长模型，评估白花蛇舌草乙醇提取物对HCC生长过程的干预作用。

白花蛇舌草（茜草科植物白花蛇舌草干燥全草,编号：0304901）。

将1kg白花蛇舌草干品与70%乙醇按1：10比例，于140℃加热回流提取1h，共3次，合并提取液并置于旋转蒸发仪中蒸发乙醇，弃清液，置于60℃真空干燥箱3d，于玻璃干燥器中冷却2h，得白花蛇舌草乙醇提取物干浸膏，出膏率8.33%。

取适量白花蛇舌草乙醇提取物粉末，以槲皮素为对照品，参照药典及课题组前期研究方法，采用UV测定总黄酮浓度，得白花蛇舌草乙醇提取物总黄酮含量为（2.47±0.14）%。

将干浸膏依次溶解于5%、10%、20%、40%、80%的DMSO中，配制成0.5、1、2、4、8mg/mL溶液，高压灭菌后-20℃冷藏备用。

阳性对照药5-FU（MCE公司，货号：HY-90006，规格：1g/瓶，纯度>98%），实验时取适量5-FU溶解于DMSO中配置成10μg/mL工作液。

4w龄SPF级BALB/c雄性裸鼠16只，体质量（18～20）g，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司（合格证编号:20180003007216；动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0643），动物伦理审批号：YYLAC-2015-036-4-2，饲养于SPF级环境。

人肝癌细胞株MHCC97-H、MHCC97-L，购自北京北纳创联生物技术研究院。

DMEM高糖培养基（HyClone公司，批号：SH30243.01）；胎牛血清（Gibco公司，批号：16000-044）；100X青、链霉素双抗混合液、胰酶（Solarbio公司，批号：P1400-100、T1300-100、R8020-25）；CCK-8试剂盒（SignalwayAntibody公司，批号：CP002）；

PI（上海七海复泰生物技术有限公司，批号：C001-200）；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C1063）；CD133、EpCAM单抗（Invitrogen公司，批号：11-1339-42、A15782）。

酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司，型号：DNM-9602）；显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司，型号：XDS-500C）；流式细胞仪（Becton-Dickinson公司，型号：AccuriC6）。

人肝癌细胞MHCC97-H、MHCC97-L培养于含10%FBS、1%青链霉素的DMEM高糖培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中传代。

取对数生长期MHCC97-H、MHCC97-L细胞悬液稀释至3×104个/mL，按96μL/孔接种于96孔板，培养过夜后同时按如下分组加药：空白对照组（加正常培养液）；

白花蛇舌草乙醇提取物0.5、1、2、4、8mg/mL组。每组3复孔，分别培养0、24、48、72、96h后弃培养液，加10μL无血清必须培养基配制的10%CCK-8溶液孵育1h，在450nm波长测定吸光度（OD值）。

细胞活性抑制率（IR%）=(1-白花蛇舌草乙醇提取物组OD值/空白对照组OD值)×100%。机率单位加权回归法计算半抑制浓度IC50。

MHCC97-H、MHCC97-L细胞各分为3组：空白对照组、白花蛇舌草乙醇提取物4mg/mL组、5-FU10μg/mL组，每组3复孔。

于35mm培养皿每皿接种MHCC97-H、MHCC97-L细胞3000个，24h后按分组处理，培养2w～3w，当多数集落细胞数>50个时终止培养，弃上清，PBS洗涤2次，5mL的4%多聚甲醛固定15min，0.1%结晶紫染色10min后冲洗、干燥。于低倍镜下计数、拍照。克隆形成率=（克隆数-接种细胞数）×100%。

MHCC97-H、MHCC97-L细胞以3×105个/孔接种至6孔板，过夜后弃培养基，按实验分组处理72h后，500r/min离心5min、PBS洗涤；

加700μL-20℃无水乙醇于4℃固定24h，3000r/min离心5min，PBS洗涤后收集细胞悬液。

加入100μL含1mg/mLRNaseA的PBS重悬，37℃避光温浴30min。每管加0.4mL50μg/mLPI溶液，避光染核10min；24h内在535nm波长处用流式细胞仪检测，FLOWJO软件分析周期。

细胞收集同1.5.5。按分组处理72h后，取10万个重悬细胞，离心后加195μLAnnexinV-FITC结合液重悬；先后加5μLAnnexinV-FITC、PI染液于4℃避光分别孵育15min和5min；1h内完成流式细胞仪检测，FLOWJO软件分析结果。

取100μL1×104个/mLMHCC97-H、MHCC97-L细胞悬液于96孔板底，按分组加药于无血清培养基。

培养14d，倒置显微镜下拍照并统计成球数。球体形成率=（球体数/接种细胞数）×100%。

MHCC97-H、MHCC97-L细胞按分组处理72h后，弃原培养基，胰酶消化、离心。取5万～10万重悬细胞离心后弃上清，加PBS200μL。

加FITC-EpCAM、PE-CD133抗体各5μL，4℃避光孵育30min后流式细胞仪检测。

裸鼠适应性饲养7d后造模。取对数生长期MHCC97-H细胞制成2×107个/mL细胞悬液。

16只裸鼠随机分成生理盐水组和白花蛇舌草乙醇提取物0.52g/kg组（相当于临床等效剂量），每组8只。

于裸鼠左侧腋窝皮下注射MHCC97-H细胞100μL，待所有肿瘤长径大于0.5cm后给药。

两组裸鼠分别灌胃白花蛇舌草乙醇提取物和生理盐水，1次/d、给药体积均为10mL/(kg·d)，连续35d，每日观察并记录小鼠一般情况，每5d测量移植瘤直径，肿瘤体积=短径2×长径/2。

白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L细胞活性抑制效力呈时间、浓度依赖性递增。

培养72h后各组细胞增殖活性、生长抑制率均明显升高（P<0.01），IC50分别为6.031(4.648，8.701)mg/mL、4.782(3.819，6.408)mg/mL。选4mg/mL白花蛇舌草乙醇提取物行后续试验。见表1。

表1白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L细胞增殖抑制率的影响（x±s，n=3）

与空白对照组相比*P<0.05(下同)。

细胞培养72h后，与空白对照组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组和5-FU组克隆形成数显着减少（P<0.01）；与5-FU组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组克隆形成数显着增加（P<0.01）。见图1、表2。

图1白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L细胞克隆形成能力的影响

表2白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L细胞克隆形成率的影响（x±s，n=3）

与空白对照组比较**P<0.01；与5-FU组相比△△P<0.01(下同)。

细胞培养72h后，与空白对照组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组和5-FU组G0/G1期比例显着增高（P<0.01），说明细胞阻滞于G0/G1期；与5-FU组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组G0/G1期比例显着减少（P<0.01）。见表3、图2。

表3白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L细胞周期的影响（x±s，n=3）

注：同一细胞周期，与空白对照组比较，**P<0.01；与5-FU组相比，△△P<0.01。

图2白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L细胞周期的影响

与空白对照组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组、5-FU组均可诱导MHCC97-H、MHCC97-L细胞凋亡（P<0.01）；与5-FU组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组凋亡率显着下降（P<0.01）。见图3，表4。

表4白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L细胞凋亡的影响（x±s，n=3）

图3白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L细胞凋亡的影响

干预MHCC97-H、MHCC97-L细胞群14d后，倒置显微镜下可见白花蛇舌草乙醇提取物组、5-FU组细胞球直径小于对照组。

与空白对照组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组、5-FU组干细胞成球率显着下降（P<0.01）；与5-FU组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组干细胞成球率显着增加（P<0.05）。见图4、表5。

图4白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L干细胞成球的影响

A：空白对照组；B：白花蛇舌草乙醇提取物组；C：5-FU组

表5白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L干细胞群的影响（x±s，n=3）

注：与空白对照组比较，**P<0.01；与5-FU组比较，△P<0.05。

干预MHCC97-H、MHCC97-L细胞群14d后，倒置显微镜下可见白花蛇舌草乙醇提取物组、5-FU组细胞球直径小于对照组。

与空白对照组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组、5-FU组干细胞成球率显着下降（P<0.01）；与5-FU组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组干细胞成球率显着增加（P<0.05）。见图5、表6。

图5白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L干细胞成球的影响

A：空白对照组；B：白花蛇舌草乙醇提取物组；C：5-FU组

表6白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L干细胞群的影响（x±s，n=3）

干预MHCC97-H、MHCC97-L细胞群14d后，倒置显微镜下可见白花蛇舌草乙醇提取物组、5-FU组细胞球直径小于对照组。

与空白对照组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组、5-FU组干细胞成球率显着下降（P<0.01）；与5-FU组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组干细胞成球率显着增加（P<0.05）。见图6、表7。

图6白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L干细胞成球的影响

表7白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L干细胞群的影响（x±s，n=3）

干预MHCC97-H、MHCC97-L细胞群72h后，与空白对照组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组、5-FU组EpCAM-CD133-细胞亚群显著增加（P<0.01），EpCAM+CD133-、EpCAM+CD133+、EpCAM-CD133+LCSCs显着减少（P<0.01）；

与5-FU组比较，白花蛇舌草乙醇提取物组EpCAM-CD133-细胞亚群显著减少（P<0.01），EpCAM+CD133-、EpCAM+CD133+、EpCAM-CD133+LCSCs显著增加（P<0.01）。见图7、表8。

表8白花蛇舌草乙醇提取物对MHCC97-H、MHCC97-L细胞群中EpCAM、CD133LCSCs的影响（x±s，n=3，%）

灌胃治疗期间各裸鼠活动、饮食、进水正常，体质量增加，无皮疹及皮下出血。

于末次给药后第2d处死所有裸鼠，完整取出移植瘤，肉眼观察移植瘤均呈类椭圆形，由2个~4个结节组成，包膜完整，界清，与周围组织粘连松弛，未见出血及坏死。

生理盐水组移植瘤最小为14.76mm×5.8mm，最大为18.78mm×10.57mm，中位大小约14mm×8mm。

白花蛇舌草乙醇提取物0.52g/(kg·d)组移植瘤最小为10.01mm×5.66mm，最大为14.96mm×7.80mm，中位大小约13mm×7mm。见图7。

图7白花蛇舌草乙醇提取物对裸鼠皮下移植瘤生长的影响

对两组裸鼠移植瘤体积进行正态性检验表明部分时间点体积呈偏态分布，故将原始体积数据进行对数转换（lnV）后进行方差分析，lnV随时间变化呈线性趋势（P<0.01），各时间点lnV存在差异（P<0.01）；组间lnV存在差异（P<0.05），两组治疗初期移植瘤体积差异无统计学意义（P>0.05），肿瘤体积呈时间依赖性增长（P<0.01）。

与生理盐水组比较，除治疗初始及治疗第20天，白花蛇舌草乙醇提取物0.52g/(kg·d)组lnV显着降低（P<0.05）。

根据指数增长模型公式进行移植瘤生长曲线拟合：

其中，a=lnV0，b为肿瘤增长速率。

对每只裸鼠移植瘤lnV进行对数线性拟合（见表9），得决定系数R2在0.973到0.994之间，表明肿瘤生长均呈指数增长模式。

表9各裸鼠移植瘤生长曲线拟合参数及肿瘤倍增、4倍时间

注：b%为肿瘤日增长速率，表示该日肿瘤体积为：上一日体积×(1+b%)mm3；肿瘤倍增时间tD=ln2/b；肿瘤四倍体积时间tQ用内插法求得：te=t1+(t2-t1)log(Ve/Vt1)log(Vt2/Vt1)，t1和t2是包围四倍肿瘤体积VQ=4V0的上下限观察时间。

基于Bootstrap法，得生理盐水组速率7.9%（7.3%，8.7%），白花蛇舌草乙醇提取物0.52g/(kg·d)组速率6.8%（6.1%，7.5%），显着降低（P<0.05）（图7C），即白花蛇舌草乙醇提取物可延缓MHCC97-H肝癌细胞移植瘤生长。

CCK-8细胞活力检测及平板克隆实验表明实验剂量白花蛇舌草乙醇提取物可抑制MHCC97-H、MHCC97-L肝癌细胞增殖。

流式细胞周期、凋亡检测结果显示白花蛇舌草乙醇提取物可阻滞肝癌细胞周期于G0/G1期，诱导细胞凋亡。

经白花蛇舌草乙醇提取物干预后细胞自我更新能力减弱，EpCAM-CD133-细胞亚群增加，表达EpCAM、CD133的亚群减少，空白对照组中CD133+EpCAM+LCSCs为EpCAM、CD133相关LCSCs中占比最高的亚群。

LCSCs是肝癌微环境中具有自我更新、分化能力的亚群，与肝癌复发、转移、耐药相关，EpCAM、CD133是其重要表面标志物，其水平与HCC复发及低生存率相关。

综合细胞行为学观察结果考虑白花蛇舌草乙醇提取物一方面通过阻滞细胞周期于G0/G1期、诱导凋亡以抑制增殖，另一方面通过抑制肝癌细胞群体中表达EpCAM、CD133的LCSCs减少肝癌微环境中干细胞亚群，尤其是CD133+EpCAM+LCSCs，以进一步抑制增殖。

白花蛇舌草乙醇提取物从多方面抑制HCC，可能与其多活性成分及各成分、多靶点作用相关。

黄酮类化合物是OD含量最高的药理学活性成分，主要含槲皮素、山奈酚、穗花双黄酮、白杨素及衍生物。

研究表明，槲皮素、山奈酚及其糖苷类衍生物通过调节AKT/mTOR、MAPK并调节其下游信号MEK1/ERK1/2、JAK2/STAT3促进自噬，抑制肝癌细胞糖酵解、迁移、侵袭；白杨素通过调节SHP-1/STAT3通路抑制SMMC-7721和MHCC97-H细胞球形成。

此外白花蛇舌草乙醇提取物中蒽醌类、环烯醚萜类也具有抗肝癌效应。

体外实验表明白花蛇舌草乙醇提取物与5-FU具有相似的抗肝癌作用，但效力弱于5-FU。

研究表明反复使用5-FU可导致肝癌细胞表观遗传学改变或基因突变，产生耐药性，可通过进一步探究白花蛇舌草乙醇提取物辅助低剂量5-FU维持抗肝癌敏感性及增效作用。

移植瘤的生长是一个动态过程，合理的肿瘤生长数学模型有助于客观且动态反映药物于体内抑瘤活性。目前用于异种移植瘤生长数学模型主要有三种：Skipper-Schaber-Wilcox模型、Delbruck-Luria模型、Gompertz模型。

本实验所用裸鼠初始体质量为18g~20g，处死裸鼠时所有移植瘤体积均不超过体质量10%，瘤组织中心未见凹陷坏死，体积呈时间依赖性增加，故不处于Gomperz模型后期营养供应不足阶段。

体外实验仅进行一个周期，故认为裸鼠产生因反复抗癌治疗相关的获得性耐药风险较低，可排除Delbruck-Luria模型。

lnV呈线性增长趋势，故本动物实验移植瘤符合Skipper-Schaber-Wilcox指数增长模型。

结合肿瘤生长数学模型进行移植瘤生长状态的评估。

其一，对体积数据进行对数转换后进行重复测量资料方差分析，通过两组肿瘤体积LnV比较反映各时间点生长差异。

其二，利用移植瘤生长全程体积数据构建肿瘤指数增长数学模型以反映移植瘤在整个治疗期的变化趋势。为了直观反映速率变化，利用对数转换后的体积进行模型构建，通过斜率反映生长速率差异及肿瘤生长延迟（图6C）。

考虑到肿瘤生长个体化差异，对每只裸鼠移植瘤体积均进行生长模型构建并估算生长速率，通过基于自助抽样法（1000次）比较两组肿瘤生长速率差异性。

结合数学模型可更为客观地反映白花蛇舌草乙醇提取物在整个治疗周期的抗肿瘤活性，表明白花蛇舌草乙醇提取物具有一定延缓MHCC97-H肝癌细胞皮下移植瘤生长作用。

综上所述，白花蛇舌草乙醇提取物可能通过阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，抑制HCC细胞群自我更新及干细胞亚群分子表达以抑制HCC细胞增殖。

通过肿瘤指数增长模型评估裸鼠MHCC97-H肝癌细胞移植瘤生长过程，表明白花蛇舌草乙醇提取物可延缓肝癌细胞体内生长。

体内外实验结果表明白花蛇舌草乙醇提取物可以抑制HCC细胞生长，可能与其多种活性成分通过多靶点抗癌机制有关，相关机制有待进一步探究。同时应着重于白花蛇舌草乙醇提取物辅助化疗药体内外抗HCC疗效，探究其在HCC治疗中的增效减毒作用。

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