扁蓿豆(对其基因克隆与生物表达有什么影响)

大家好,今天小编来为大家解答以下的问题，关于扁蓿豆，对其基因克隆与生物表达有什么影响这个很多人还不知道，现在让我们一起来看看吧！

文丨初八没烦恼

编辑丨初八没烦恼

扁蓿豆又名花首着、野首、扁豆子等，是豆科首着属长寿命的草本植物，最早记载于1753年，因其生长习性、植株形态、染色体数目及核型等特征与胡卢巴属植物相似，被归属于胡卢巴属。

其为多年生异花授粉植物，花冠黄褐色带深紫色的条纹，呈总状花序，自下而上依次开放，叶为羽状三出复叶，小叶矩圆状倒披针形或矩圆状楔形，基部具有细齿。

扁蓿豆生态适应性广，在我国分布于东北、华北、西北和西南地区，内蒙古主要分布在东部地区。

温度作为植物生命活动中最基本的外界因子之一,直接影响着植物地上部分的生长发育，同时也间接影响植物根系的生长和发育。

在应对低温不利环境条件时，植物细胞组织内部会发生一系列的生理适应反应，通过提高具有保护作用的渗透调节物质，如可溶性蛋白、可溶性糖，抗氧化剂系统。

如超氧化物歧化酶、过氧化物酶等物质的含量和活性来抵御低温造成的伤害，而这些物质也常被作为评价植物抗寒能力的重要指标。

实验结果表明，不同生长年限直立型扁蓿豆可溶性蛋白含量的变化趋势较为一致，各器官间的可溶性蛋白含量略有不同，叶>茎>根。

从7月-9月，随着气温的缓慢下降，幼苗中可溶性蛋白含量略有上升，随着秋季气温的迅速下降，扁蓿豆叶片最先受到影响，地上部分逐渐枯萎，营养物质逐渐向根系运输转移，根颈可溶性蛋白含量迅速上升。

其中3年生直立型扁蓿豆的可溶性蛋白含量上升幅度最大，至翠年1月根茎可溶性蛋白含量高达192.86mg/g是越冬前的6.78倍。

可溶性蛋白可增强扁蓿豆原生质胶体的保水能力，从而提高扁蓿豆的抗寒性，使扁蓿豆安全越冬。

在低温胁迫处理条件下，直立型扁蓿豆幼苗叶、茎和根的可溶性蛋白含量，均呈“s型”变化趋势，不同器官可溶性蛋白含量整体也表现为叶>茎>根。

低温胁迫初期，幼苗的不同器官可溶性蛋白含量变化较小，随着低温胁迫时间的延长，幼苗叶、根、茎中可溶性蛋白含量显著上升。

分别在36h、48h和60h达到可溶性蛋白最高水平，是对照可溶性蛋白含量的1.52倍、1.5倍和1.27倍，同时直立型扁蓿豆植株在48h后开始逐渐出现萎蒿和下垂。

其中，低温胁迫36h-48h期间，直立型扁蓿着豆幼苗叶中可溶性蛋白含量显著下降的同时，根部的可溶性蛋白含量显著上升。

说明直立型扁蓿豆幼苗随着低温胁迫时间的延长，叶中的营养物质逐渐向根部转移，当低温处理时间达到48h，直立型扁蓿豆可溶性蛋白含量表现为叶>根>茎。

整体说明，直立型扁蓿豆叶片最先感知低温，作为保护剂的可溶性蛋白不断产生并大量积累，并逐渐向根部转移，根部可溶性蛋白含量不断累积保护扁蓿豆幼苗抵御寒冷。

可溶性糖含量与可溶性蛋白含量的变化趋势相似，但各器官中可溶性糖含量差异表现是根>茎>叶。

从7月-9月，随着气温的缓慢降低幼苗中可溶性糖含量略有增加，随着秋季气温的迅速降低，地上部枯萎，根系中淀粉等贮藏物质大量分解，根颈可溶性糖含量急速上升。

其中3年生材料可溶性糖含量增加幅度较大，至翌年1月根茎可性糖含量达638.765mg/g，为越冬前的6.49倍。

可溶性糖也是一种低温保护剂，通过提高扁猎豆内细胞液的浓度，维持细胞膜的稳定，从而提高扁蓿豆的抗寒性，使扁蓿豆安全越冬。

冷诱导基因是指在低温胁迫过程中诱导产生的基因，低温胁迫不仅能调节植物基因的表达，也促使植物合成许多新的蛋白质。

1989年Mohapatra在紫花首中发现了新型冷诱导基因CAS，该基因蛋白在零下低温胁迫条件下累积到非常高的水平。

到目前为止首着中已分离鉴定出的相关冷诱导基因蛋白有CASI5A、CASI5B、CASI7、CASI8、CAS19、CAS3I等，它们都有相似的CRT/DRE抗寒元件，并通过转录水平调控首着的抗寒。

从0度低温处理每隔12h至84h的直立型扁蓿豆幼苗嫩叶中提取RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

可清晰看见RNA的28S和18S条带，且带型完整，只有36h有拖尾现象，说明RNA有降解，需后期新提取36h叶片RNA。

其他RNA的OD260/OD280介于1.8~2.0之间，RNA纯度较高，符合后续试验对RNA的要求。

以反转录的CDNA为模板，引物PP进行RT-PCR，扩增扁蓿豆CASI5A、CAS15B和CASI8基因，但其中CAS8基因在扁豆中不表达。

将扩增获得的CASI5A和CASI5B目的片段进行回收纯化，并与pMD19-TSimple载体进行连接。

连接产物转化，阳性克隆筛选后的菌液送至上海生工进行测序，获得一条大小637bp和611bp的片段。

利用BLAST软件对获得的扁蓿豆CAS15A和CAS15B基因片段序列，进行分析扁豆CAS15A基因包含了一个399bp的开放阅读框，推测编码了133个氨基酸。

以MRActim为内参基因，对CAS基因进行定量表达分析，以期了解CAS基因在扁蓿豆低温胁迫过程中的表达模式。

实验结果可知，CAS和内参基因的熔解曲线峰单一、锋利，总体说明荧光定量PCR扩增产物特异性较好。

荧光定量PCR结果表明，低温处理对直立型扁蓿豆CASI5A和CASI5B基因表达的影响较大，CAS15A在冷处理48h表达量大幅度增加，冷处理第72h达到最大值是未经过低温处理的100倍。

而CASI5B在冷处理36后表达量大幅度增加于84h达到最大值，是未经过低温处理对照的93倍。

直立型扁蓿豆CAS15A和CASI5B基因的相对表达量虽然在冷处理84h后都有所下降，但相对表达量都达到对照的71倍以上，仍处于很高的相对表达量水平。

由此说明直立型扁蓿豆CAS基因属于冷诱导基因，其表达量是随着低温胁迫诱导时间的延长而逐渐增加的。

嫩叶的总RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，稀释后在紫外分光光度计下，条带清晰。

可以看到28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA，且28SrRNA条带亮度约为18SrRNA条带亮度的两倍，表明RNA质量较好。

合成的双链CDNA产物呈弥散状，集中在500-1800bp之间，OD260/OD280也介于1.8-2.0之间，表明合成的CDNA质量较好。

植物首先感受到低温信号，然后通过一系列的生理生化反应及基因表达，产生抗寒性能，但具体的信号调控网络较为复杂。

植物受到低温胁迫后，光合作用下降，呼吸作用增强，能量和物质消耗增强，但能量的产生和物质的合成方面受阻，使得植物处于饥饿状态，需要合成与水解大量的糖类及蛋白质来适应低温环境。

从扁蓿豆中筛选出的58个TDFS中，参与代谢调节的基因数量最多，有与糖代谢相关的葡萄糖焦磷酸化酶、与能量相关的DEAD-boxRNA解旋酶、与核酸代谢相关的蛋白及光合作用相关蛋白等几种。

葡萄糖焦磷酸化酶、DEAD-boxRNA解旋酶、核糖体蛋白、光系统工蛋白等均参与植物对低温胁迫应答。

植物在低温胁迫过程中，内在分子机制也调控着一系列生理生化变化，分离得到镁离子鳌合酶、半胱氨酸蛋白酶、受体蛋白激酶等与信号转导有关的基因片段。

镁离子整合酶作为脱落酸信号转导的正调控因子，参与诱导植物产生对逆境的抗性，半胱氨酸蛋白酶也在低温、干旱和盐胁迫等逆境胁迫中负责蛋白的周转。

转录因子的转录调控在植物逆境胁迫过程中起重要作用，可激活一系列抗逆相关功能基因的表达来提高植物整体的抗逆性。

筛选出了与抗寒相关的转录因子五聚体泛素、锌指蛋白、硒蛋白等，泛素作为识别信号，通过蛋白酶途径使植物在低温胁迫中产生抗性。

锌指蛋白广泛参与抗逆等多种重要生命过程，锌指蛋白的上调表达可使植物的耐寒性提高。

硒是高等植物的必需微量元素，豆科植物对硒的积聚能力较强，仅次于十字花科植物，硒蛋白主要起到抗氧化损伤的功能。

此外，还得到了热激蛋白、类甜蛋白、FRIGIDA蛋白、富含脯氨酸蛋白等防御蛋白，说明上述蛋白也均与植物抗寒相关。

其中，FRIGIDA基因编码了一个盘绕蛋白，长时间冷处理后启动型显性基因FRI促进FLC乙酰化的表达，这也表明，FRI基因与低温胁迫相关。

富含脯氨酸蛋白属于细胞伸展蛋白，在植物受低温胁迫时，提高幼嫩的组织器官在低温条件下的防护和修复能力。

直立型扁蓿豆在低温胁迫条件下，细胞质膜发生相变，导致Ca2+大量涌入，细胞质内钙含量的变化激活了许多蛋白磷酸化酶、蛋白激酶和一些转录因子等。

MRPP2C最先对冷信号进行响应并表达，通过信号传导激活蛋白酶的蛋白质磷酸化代谢过程，保护植物免受低温伤害。

通过分析扁蓿豆抗寒相关基因，与其他植物抗寒基因结构和表达的差异，及基因表达与生理生化指标间的相关等表达特性，为苜蓿属牧草的抗寒育种研究提供理论依据。

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